Некоторые варианты иммуноферментного анализа
Следует отметить, что наибольшее количество вариантов ИХА с маркерами относится к иммуноферментному анализу, в то же время варианты с использованием парамагнитных меток и бактериофагов остаются в стадии научного исследования.
Иммуноферментный анализ был предложен в начале 70-х гг. прошлого века тремя независимыми группами исследователей: Engvall и Perlmann в Швеции, van gt;№emen и Schuur в Нидерландах, Rubenstein с сотрудниками в США. Сущность метода состоит в том, что с помощью известных Аг или Ат, конъюгированных с ферментами, выявляют специфические Ат или Аг в исследуемой системе. О количестве вступивших во взаимодействие компонентов судят по превращению субстрата фермента.
ИФА используется для анализа широкого круга соединений — вирусных и бактериальных антигенов, белков сыворотки, фармакологических препаратов, пептидных и стероидных гормонов, пестицидов и т.д. Чувствительность определения составляет до 0,001 нг/л, при этом нет необходимости иметь очищенные препараты, поскольку можно проводить определение искомого компонента даже в составе сложных многокомпонентных систем.
К преимуществам ИФА по сравнению с РИА относится ббльшая стабильность реагентов, сокращение времени анализа, отсутствие необходимости в специальных мерах защиты, потому что такой вариант безопасен для здоровья.
Привлекательность ИФА состоит еще и в том, что срок службы ферментов-маркеров составляет несколько лет, он применим ко всем комплексам Аг—Ат, позволяет обнаруживать Аг в ничтожно малых концентрациях (10"14—10‘12 М). В научной и патентной литературе есть сведения о рекордных пределах обнаружения веществ данными методами (вплоть до 10‘21 М в образце). Такие результаты достигаются благодаря использованию ферментов — биокатализаторов, позволяющих создавать каскадные системы усиления химических сигналов.
Процесс ИФА можно разделить на три основные стадии, причем после каждой стадии необходима промывка компонентов: формирование специфического комплекса Аг—Ат; введение в него ферментной метки; визуализация метки каким-либо физическим способом.
Разработано более тридцати различных вариантов ИФА, имеющих как принципиальные, так и второстепенные отличия. Напри-
мер, различия в способах разделения компонентов иммунохимичес- кой реакции привело к созданию гомогенных н гетерогенных вариантов ИФА.
Наиболее широкое распространение на практике получил гетерогенный (твердофазный) ИФА, чему способствовала разработка в качестве носителей для сорбционной иммобилизации Ат или Аг специальных полистирольных планшетов, содержащих 96 лунок (рис. 2.17).
Твердофазный ИФА, или, как его обозначают в литературе, ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSoibent Assay), основан на использовании различных твердых носителей для сорбционной или ковалентной иммобилизации одного из компонентов иммунологической реакции с последующим специфическим связыванием анализируемого соединения на иммуносорбенте и выявлении образовавшихся иммунокомплексов с помощью меченых ферментами компонентов.
Многообразие методов ИФА обусловлено возможностью введения ферментной метки как в молекулу Ат, так и в молекулу Аг, а также многообразием носителей для иммобилизации одного из компонентов иммунохимических реакций. Для конкретной схемы анализа определяющим является, какой из реагентов — Ат или Аг — использован в иммобилизованном виде для отделения иммунных комплексов от не связавшихся компонентов.
Приготовление иммуносорбентов проводят либо ковалентным связыванием, либо адсорбцией белка на поверхности носителя. При получении иммуносорбентов путем ковалентного связывания с помощью различных бифункциональных реагентов применяются такие носители, как целлюлоза, сефароза, сефадекс, агароза, пористое стекло, и используются те же методы и приемы, что и при получении препаратов иммобилизованных ферментов.
Многие вещества (белки, полисахариды, пептидные гормоны, денатурированная ДНК и т.д.) могут быть адсорбционно связаны с поверхностью пробирок, микроплат из непористых полимеров — полистирола, поливилхлорида, акрилекса, полиметилметакрилата. Связь с матрицей осуществляется в данном случае за счет гидрофобных и электростатических взаимодействий. Эта связь более лабильна чем ковалентная, однако легкость разделения компонентов по окончании реакции, достигаемая простой промывкой пробирок и планшетов, обеспечивает широкое применение этого метода.
Наиболее интенсивно используются 96-луночные планшеты, изготовленные из оптически прозрачного полистирола, позволяющие проводить все стадии анализа, начиная с иммобилизации Ат (или Аг) и заканчивая измерением физического параметра ферментативной реакции в каждой лунке (см. рис. 2.17, а, б, в, г).
С полистиролом могут быть связаны как Ат, так и Аг различной природы (белки, гликопротеины, липополисахариды, пептидные гормоны и т.д.). Количество адсорбированного вещества зависит от многих условий (температуры, pH, ионной силы, времени инкубации, присутствия в смеси дополнительных компонентов) и изменяется при их варьировании.
К недостаткам данных пористых материалов относится невысокая емкость материалов и возможность потери части адсорбированного белка с подложки в процессе промывок, из-за чего ухудшается чувствительность и воспроизводимость результатов.
Формально предел обнаружения Аг данным методом лимитируется только пределом детекции метки. Наиболее часто до последнего времени для этих целей использовали различные спектрофотометрические методы. В то же время определенные преимущества имеют электрохимические способы регистрации ферментной метки, поскольку они лишены таких недостатков, свойственных спектроскопическим методам, как невозможность анализа в мутных пробах,
в качестве носителей специальных полистирольных планшетов:
в - иммобилизация фермента на дне ячейки планшета, добавление соответствующего буферного
раствора; б - процесс внесения пробы и индикаторного соединения; в - инкубация и добавление в
ячейку соответствующего субстрата; г - фиксирование времени достижения необходимой окраски
тушение флуоресценции, помехи со стороны поглощающих или флуоресцирующих соединений, обычно присутствующих в биологических пробах. К недостаткам же следует отнести возможную электрохимическую активность компонентов пробы, что приводит к наложению наблюдаемых аналитических сигналов.
Наиболее часто используемыми гетерогенными вариантами им- муноферментного анализа являются прямой конкурентный и непрямой иммуноферментный с использованием вторичных антител.
В прямом конкурентном иммуноферментном анализе также используется ферментная метка. Ат, связанные с твердой фазой, присутствуют в ограниченном количестве. Принцип конкурентного ИФА состоит в одновременном добавлении определяемого и меченого ферментом антигенов к антителам, доведении системы до равновесного состояния и последующем измерении ферментативной активности метки в комплексе с Ат или в несвязанном меченом Аг. На первом этапе анализа проводят присоединение Ат к носителю за счет физической или химической иммобилизации. Избыток Ат удаляют промыванием планшета или другого используемого носителя. Вносят строго определенное количество меченого Аг и различные количества немеченого Аг, проводят иммунологическую реакцию, затем добавляют субстрат и проводят ферментативную реакцию. Концентрация продуктов ферментативной реакции, регистрируемая через определенный интервал времени, обратно пропорциональна концентрации растворенного Аг. Количество связавшегося фермента (антигена) определяют после добавления субстрата, например по интенсивности окраски раствора, обусловливаемой продуктом (Р) преобразования субстрата (см.
При анализе непрямым иммуноферментным методом (неконкурентный вариант) с использованием двойных (вторичных) Ат к носителю с иммобилизованными антителами добавляют раствор, содержащий анализируемый антиген. В процессе инкубации на первой стадии на твердой фазе (обычно на поверхности планшета для микротитрования) образуется специфический комплекс антиген-анти- тело (см. рис. 2.15, стадия 1); после установления в системе равновесия промывают носитель для удаления не связавшихся компонентов
и добавляют меченые ферментом антитела (см. рис. 2.15, стадия 2). Вторично доводят реакцию до равновесного состояния и после удаления избытка конъюгата антител с ферментом добавляют субстрат и регистрируют количество метки, связавшейся с иммуносорбентом путем оценки ферментативной активности (см. рис. 2.15, стадия 3). Ферментативная активность пропорциональна начальной концентрации определяемого антигена. На стадии выявления специфического иммунокомплекса Аг оказывается в фиксированном положении между молекулами иммобилизованных и меченых Ат («сэндвич»- анализ).
Такой вариант ИФА требует большего времени и операций, чем конкурентный анализ, однако обладает существенным преимуществом — высокой чувствительностью, превосходящей возможности других схем твердофазного ИФА. Эффективность определения специфического комплекса на каждой стадии анализа зависит от константы связывания комплекса Аг—Ат и концентрации компонентов. «Сэндвич»-метод за счет избытка иммобилизованных и меченых ферментом Ат дает возможность сдвигать равновесие в сторону образования специфических комплексов.
В гомогенном ИФА, или EMIT-анализе (Enzyme Multiply ImmunoTechnic), активность фермента-маркера изменяется в процессе иммунологической реакции, а определение степени ее протекания осуществляется непосредственно в гомогенном растворе. В этом случае необязателен этап физического разделения компонентов, как это требуется в гетерогенном варианте. Методами этого типа чаще всего определяют вещества с относительно низкой молекулярной массой, например лекарства, гормоны, пестициды, другие гап- тены.
В гомогенных способах происходит слияние первых из двух описанных стадий: взаимодействие Ат с гаптеном, находящимся вблизи активного центра фермента, приводит одновременно к ингибированию каталитической активности, причем оба процесса соединены в пространстве и во времени. На второй стадии необходимо добавлять субстрат, чтобы «проявить» свободный фермент (рис. 2.18).
Возможны варианты, в которых все три стадии ИФА соединены в одну. Например, два Ат, меченные ферментами, образующими би- ферментную систему, в которой продукт первого фермента является субстратом для второго, дают в растворе комплекс с исследуемым Аг (рис. 2.19). В роли таких ферментов часто используют глкжозоокси- дазу, пероксидазу, малатдегидрогеназу и т.д.
Рис. 2.18. Гомогенный иммуноферментный анализ: стадия 1 - образование иммунного комплекса; стадия 2 - визуализация образования иммунного комплекса: Е - фермент; S - субстрат; Р - продукт ферментативной реакции
В любом варианте ИФА изменяется ферментативная активность меченого соединения, находящегося или в специфическом иммунном комплексе или же в комплексе со свободными, не вступившими в реакцию центрами связывания. Например, при использовании гап- тена, конъюгированного с ферментом, связывание гаптена с Ат приводит к снижению активности фермента из-за блокирования его активного центра. Таким образом, степень восстановления ферментативной активности анализируемого образца в присутствии свободного гаптена позволяет определять его количество.
В качестве метки могут использоваться не только ферменты, но и кофакторы, ингибиторы, простетические группы, субстраты и т.д.
Большинство иммуноферментных тестов базируется на спектрофотометрическом, флуориметрическом методах, а в последние годы — все чаше на хемилюминесцентном методе определения активности ферментов. С практической точки зрения заслуживает внимания использование в ИФА электрохимического контроля за ходом ферментативной реакции.